SEPLIFE ®Tutto quello che devi sapere sulla cromatografia a scambio ionico

Introduzione alla cromatografia a scambio ionico:

La cromatografia a scambio ionico è un metodo cromatografico su colonna che sfrutta la differenza di forza elettrostatica tra gli ioni scambiabili sullo scambiatore ionico e i vari ioni separati nel mezzo circostante, ottenendo la separazione attraverso l'equilibrio di scambio. La cromatografia a scambio ionico presenta i vantaggi di elevata sensibilità, ripetibilità, buona selettività e velocità di analisi, ed è attualmente uno dei metodi cromatografici più comunemente utilizzati. 

Nel 1848, Thompson et al. scoprirono il fenomeno dello scambio ionico durante lo studio dello scambio di sostanze alcaline nel suolo. Negli anni '40, apparvero le resine a scambio ionico in polistirene con caratteristiche di scambio stabili. Negli anni '50, la cromatografia a scambio ionico entrò nel campo della biochimica e fu applicata all'analisi degli amminoacidi. Attualmente, la cromatografia a scambio ionico è ancora un metodo cromatografico comunemente utilizzato in biochimica ed è ampiamente utilizzata nella separazione e purificazione di varie sostanze biochimiche come amminoacidi, proteine, zuccheri, virus e nucleotidi.

Il processo di scambio ionico:  

La reazione tra lo scambiatore ionico e gli ioni o i composti ionici presenti nella soluzione avviene principalmente per scambio ionico. La reazione di scambio ionico è reversibile. Supponendo che RA rappresenti lo scambiatore cationico, il catione A+ dissociato nella soluzione può subire una reazione di scambio reversibile con il catione B+ presente nella soluzione, e la formula di reazione è:

RA + B+ → RB + A+

La reazione raggiunge l'equilibrio a una velocità estremamente rapida e lo spostamento dell'equilibrio segue la legge dell'azione di massa. 

La selettività di uno scambiatore ionico può essere espressa dalla costante di equilibrio K della sua reazione:

K＝[RB][A+]/[RA][B+]

✔Se [A+] è uguale a [B+] nella soluzione di reazione, allora K=[RB]/[RA].

✔Se K>1, cioè [RB]>[RA], significa che la forza di legame dello scambiatore ionico a B+ è maggiore di quella di A+;

✔Se K=1, cioè [RB]=[RA], significa che lo scambiatore ionico ha la stessa forza di legame con A+ e B+;

✔Se K

✔Il valore K è un parametro che riflette la forza di legame o la selettività dello scambiatore ionico verso i diversi ioni, quindi il valore K è chiamato coefficiente di selettività dello scambiatore ionico per A+ e B+.

Meccanismo di scambio ionico:

A+ si diffonde dalla soluzione alla superficie della resina.

L'A+ penetra nel centro attivo all'interno della resina dalla superficie della resina.

A+ subisce una reazione di metatesi con RB sul centro attivo.

Lo ione B+ desorbito si diffonde dall'interno della resina alla sua superficie.

Gli ioni B+ si diffondono dalla superficie della resina nella soluzione.

La fase di controllo della velocità di scambio è la velocità di diffusione, che può essere controllata tramite diffusione interna o diffusione esterna in diversi sistemi di separazione.

Fattori che influenzano il processo di scambio ionico: 

✔Dimensione delle particelle: più piccole, più veloci

✔Grado di reticolazione: basso grado di reticolazione, velocità di scambio elevata

✔Temperatura: più è alta più è veloce, è correlata all'aumento del coefficiente di diffusione

✔Valenza ionica: maggiore è la valenza, più lenta è la velocità di diffusione

✔Dimensione degli ioni: più piccoli sono, più veloci

✔ Velocità di agitazione: in una certa misura, più è grande, più è veloce

✔Concentrazione della soluzione: quando il tasso di scambio è controllato dalla diffusione, maggiore è la concentrazione, più veloce è il tasso di scambio

Principio dello scambio ionico:

Se si sceglie una resina a scambio cationico, la sostanza carica positivamente viene scambiata con H+ e legata alla resina. Se si sceglie una resina a scambio anionico, la sostanza carica negativamente può essere scambiata con OH- e legata alla resina.

Esistono differenze nel grado di compattezza della combinazione di sostanze sulla resina e i componenti della miscela possono essere eluiti uno alla volta selezionando un eluente appropriato per raggiungere lo scopo di separazione e purificazione.

✔1. Fase di equilibratura: combinazione di scambiatore ionico e controione

✔2. Fase di adsorbimento: campione e controscambio ionico

✔3. Fase di desorbimento: la soluzione tampone a gradiente lava via prima le sostanze debolmente adsorbite e poi quelle fortemente adsorbite

✔4. Fase di rigenerazione: lavaggio completo con la soluzione di bilanciamento originale, che può essere riutilizzata

Resine per cromatografia a scambio ionico:

I gruppi carichi degli scambiatori cationici sono caricati negativamente, mentre gli ioni contro sono caricati positivamente, il che può portare a reazioni di scambio con cationi o composti caricati positivamente in soluzione.

In base alla forza del gruppo caricato, può essere suddiviso in tre tipi, rispettivamente tipo acido forte (gruppo con acido solfonico, R-SO3H), tipo acido medio-forte (contenente gruppo acido fosforico o gruppo acido fosforoso, R-PO3H2) e tipo acido debole (con gruppo carbossilico e resina a base di fenolo, R-COOH o anello R-benzene-OH).

Durante lo scambio di questi scambiatori, gli ioni idrogeno vengono sostituiti da cationi estranei, come mostrato nella seguente formula:

R－COOH＋Na+＝R－COONa＋＋H+

Lo scambiatore anionico viene formato introducendo gruppi ammina quaternaria [-N (CH3) 3], ammina terziaria [-N (CH3) 2], ammina secondaria [-NHCH3] e ammina primaria [-NH2] sulla matrice.

In base al diverso livello di alcalinità dei gruppi amminici, si possono dividere in tre tipi, rispettivamente fortemente basici (inclusi i gruppi amminici quaternari), debolmente basici (inclusi i gruppi amminici terziari e secondari) e mediamente basici (contenenti sia un gruppo basico forte che un gruppo basico debole).

Quando si scambiano con gli ioni in soluzione, la formula di reazione è la seguente:

Per maggiori informazioni sui tipi specifici di resine per cromatografia a scambio ionico, continuate a leggere il nostro prossimo articolo sulla cromatografia a scambio ionico.