Selezione dei supporti per cromatografia a scambio ionico

Il processo di separazione e purificazione delle biomacromolecole mediante cromatografia a scambio ionico viene eseguito principalmente sfruttando le proprietà di dissociazione di varie molecole, la carica netta degli ioni e la differenza elettrica nella distribuzione superficiale della carica. È diventata una delle tecniche di purificazione più utilizzate per la separazione e la purificazione di sostanze biochimiche, proteine, peptidi e altre sostanze.

Nella separazione e purificazione, la colonna deve avere un'elevata capacità di carico, facilità d'uso e lunga durata. Il mezzo di separazione è il fattore più importante. Pertanto, la sua scelta è particolarmente importante.
 

1. Selezione delle varietà:

Un adatto  mezzo cromatografico a scambio ionico  Il mezzo di separazione deve essere selezionato in base al tipo di carica, alle dimensioni della molecola, alle proprietà fisico-chimiche e al microambiente del prodotto target da separare e purificare. Per le piccole molecole inorganiche, la scelta del mezzo di separazione è relativamente semplice, ma per le biomacromolecole è necessario considerare ulteriori fattori.

Le biomacromolecole, come le proteine, sono composte da una varietà di amminoacidi, che presentano diverse proprietà elettriche in diverse condizioni di pH, e hanno requisiti specifici per l'ambiente di pH più adatto. Pertanto, è necessario innanzitutto comprendere la proteina bersaglio, ecc. Il punto elettrico e il microambiente appropriato, in base a queste condizioni, selezionano le specie di scambiatori ionici più appropriate.

La scelta tra uno scambiatore cationico o uno scambiatore anionico dipende principalmente dalla carica del materiale separato al suo pH stabile. Se la carica è positiva, si sceglie lo scambiatore cationico; se la carica è negativa, si sceglie lo scambiatore anionico. Ad esempio, il punto isoelettrico della proteina da separare è 4 e l'intervallo di pH stabile è 6-9. Poiché la proteina è carica negativamente in questo momento, per la separazione è opportuno scegliere uno scambiatore anionico.
 

2. Selezione dello scheletro: 

Lo scambiatore di ioni a matrice appropriata deve essere selezionato in base alla resa del prodotto target, alla purezza richiesta e al valore economico.

La resina a scambio ionico in polistirene per uso generico presenta le seguenti caratteristiche: struttura stabile, prezzo contenuto, elevata capacità di scambio totale ed è adatta per l'estrazione e la separazione di prodotti biochimici generici come antibiotici, acidi organici, risorse animali o vegetali. Per alcuni prodotti di ingegneria genetica ad alto valore aggiunto che richiedono elevata risoluzione ed elevata purezza, sono ancora necessari mezzi di separazione biochimici a base di cellulosa, destrano e agarosio.

Gli scambiatori ionici in cellulosa sono relativamente economici, ma hanno bassa risoluzione e stabilità e sono adatti per la separazione iniziale e la preparazione di grandi volumi. La risoluzione e il prezzo dello scambiatore ionico a destrano sono moderati, ma l'influenza esterna è notevole e il volume può variare notevolmente al variare della forza ionica e del pH, influenzando la risoluzione. Gli scambiatori ionici in agarosio hanno una buona stabilità meccanica e un'elevata risoluzione, ma sono più costosi.

Il mezzo di separazione ideale non dovrebbe essere solo facilmente adsorbibile, ma anche facile da eluire. Se il prodotto target non è sensibile alle variazioni di forza ionica e pH, si può prendere in considerazione un mezzo forte con una carica elevata o un'alcalinità elevata con un'elevata densità di carica. Se questi fattori sono sensibili, si dovrebbero utilizzare mezzi deboli o debolmente alcalini. Se la sostanza macromolecolare viene adsorbita, la combinazione è relativamente forte e spesso difficile da eluire. Se si utilizzano condizioni difficili per causare la denaturazione delle macromolecole, si dovrebbe selezionare un mezzo con una bassa densità di gruppi funzionali.

Mezzo fortemente acido o fortemente alcalino con un ampio intervallo di pH. Viene spesso utilizzato per separare piccole molecole o separare a pH estremi. Tuttavia, a causa delle sue forti proprietà elettriche, a volte denatura facilmente o perde alcune biomolecole sensibili vive. I mezzi deboli debolmente acidi o debolmente alcalini hanno un ampio intervallo di selettività e non sono facili da inattivare le proteine. Pertanto, sono generalmente adatti per la separazione di macromolecole come le proteine, ma il loro intervallo di pH è ristretto.
 

3. Selezione della dimensione delle particelle:

La dimensione del mezzo di separazione ha un effetto significativo sulla risoluzione e sulla portata della colonna cromatografica a scambio ionico. Generalmente, il mezzo di separazione ha una piccola dimensione delle particelle e un'alta risoluzione, ma lo ione all'equilibrio ha un lungo tempo di equilibrio e una bassa portata; quando la dimensione delle particelle è grande, la colonna ha una portata relativamente elevata e una piccola caduta di pressione, ma la risoluzione è bassa e il carico è ridotto. Pertanto, il mezzo di separazione per particelle grandi è adatto per la separazione preparativa su larga scala, che non è richiesta per la risoluzione, mentre il mezzo di separazione per particelle piccole è adatto per la separazione fine che richiede un'alta risoluzione o una fase di raffinazione del prodotto.