Selezione dei mezzi per cromatografia a scambio ionico

Il processo di separazione e purificazione delle biomacromolecole mediante cromatografia a scambio ionico viene effettuato principalmente utilizzando le proprietà di dissociazione di varie molecole, la carica netta degli ioni e la differenza elettrica della distribuzione della carica superficiale. È diventata una delle tecniche di purificazione più frequentemente utilizzate per la separazione e la purificazione di sostanze biochimiche, proteine, peptidi e altre sostanze.

Nella separazione e purificazione, la colonna deve avere un'elevata capacità di carico, facilità d'uso e lunga durata. Il mezzo di separazione è il fattore più importante. Pertanto, la scelta del mezzo di separazione è particolarmente importante.
 

1. Selezione delle varietà:

Adatto  mezzo per cromatografia a scambio ionico  dovrebbe essere selezionato in base al tipo di carica, alla dimensione della molecola, alle proprietà fisico-chimiche e al microambiente del prodotto target da separare e purificare. Per le piccole molecole inorganiche, la scelta del mezzo di separazione è relativamente semplice, ma per le biomacromolecole è necessario considerare più fattori.

Le biomacromolecole come le proteine ​​sono composte da una varietà di amminoacidi, che presentano proprietà elettriche diverse in diverse condizioni di pH, e le biomacromolecole hanno requisiti specifici per l'ambiente di pH più adatto. Pertanto, è necessario prima comprendere la proteina bersaglio, ecc. Il punto elettrico e il microambiente appropriato, in base a queste condizioni, selezionano le specie di scambiatore ionico appropriate.

La scelta tra uno scambiatore cationico o uno scambiatore anionico dipende principalmente dalla carica del materiale separato al suo pH stabile. Se è caricato positivamente, viene selezionato lo scambiatore cationico; se caricato negativamente, viene selezionato lo scambiatore anionico. Ad esempio, il punto isoelettrico della proteina da separare è 4 e l'intervallo di pH stabile è 6-9. Poiché in questo momento la proteina è caricata negativamente, per la separazione dovrebbe essere selezionato uno scambiatore anionico.
 

2. Selezione dello scheletro: 

Lo scambiatore ionico a matrice (matrice) appropriato deve essere selezionato in base alla resa del prodotto target, alla purezza richiesta e al valore economico.

La resina a scambio ionico di polistirene per uso generale ha le caratteristiche di struttura stabile, prezzo basso, elevata capacità di scambio totale ed è adatta per il processo di estrazione e separazione di prodotti biochimici generali come antibiotici, acidi organici, risorse animali o risorse vegetali. Per alcuni prodotti di ingegneria genetica ad alto valore aggiunto che richiedono alta risoluzione ed elevata purezza del prodotto, sono ancora necessari mezzi di separazione biochimica a base di cellulosa, destrano e agarosio.

Gli scambiatori di ioni cellulosa sono relativamente economici, ma hanno bassa risoluzione e stabilità e sono adatti per la separazione iniziale e la preparazione della massa. La risoluzione e il prezzo dello scambiatore ionico destrano sono moderati, ma l'influenza esterna è ampia e il volume può cambiare notevolmente con il cambiamento della forza ionica e del pH, influenzando la risoluzione. Gli scambiatori di ioni di agarosio hanno una buona stabilità meccanica e un'alta risoluzione, ma sono più costosi.

Il mezzo di separazione ideale non dovrebbe solo essere facilmente adsorbito, ma anche facile da eluire. Se il prodotto target non è sensibile ai cambiamenti della forza ionica e del pH, si può prendere in considerazione un mezzo forte con una carica forte o una forte alcalinità con un'elevata densità di carica. Se questi fattori sono sensibili, è necessario utilizzare mezzi deboli o debolmente alcalini. Se la sostanza macromolecolare viene adsorbita, la combinazione è relativamente forte ed è spesso difficile da eluire. Se vengono utilizzate condizioni difficili per provocare la denaturazione delle macromolecole, è necessario selezionare un mezzo con una bassa densità di gruppi funzionali.

Mezzo fortemente acido o fortemente alcalino con un ampio intervallo di pH. Viene spesso utilizzato per separare piccole molecole o separarle a pH estremi. Tuttavia, a causa delle sue forti proprietà elettriche, a volte denatura facilmente o perde dal vivo alcune biomolecole sensibili. I terreni deboli debolmente acidi o debolmente alcalini hanno un ampio intervallo di selettività e non sono facili da inattivare le proteine. Pertanto, sono generalmente adatti per la separazione di macromolecole come le proteine, ma il loro intervallo di pH è ristretto.
 

3. Selezione della dimensione delle particelle:

La dimensione del mezzo di separazione ha un effetto significativo sulla risoluzione e sulla portata della colonna cromatografica a scambio ionico. Generalmente, il mezzo di separazione ha una dimensione delle particelle piccola e un'alta risoluzione, ma lo ione all'equilibrio ha un tempo di equilibrio lungo e una velocità di flusso lenta; quando la dimensione delle particelle è grande, la colonna ha una portata relativamente veloce e una caduta di pressione ridotta, ma la risoluzione è bassa e il carico è piccolo. Pertanto, il mezzo di separazione di particelle grandi è adatto per la separazione preparativa su larga scala che non è richiesta per la risoluzione, e il mezzo di separazione di particelle piccole è adatto per la separazione fine che richiede un'elevata risoluzione o uno stadio di raffinazione del prodotto.