Ni Seplife ®Mezzi per cromatografia di affinità 6FF (IDA).

Resina per cromatografia di agarosio chelante al nichel

Ni Seplife 6FF (IDA) Istruzioni

Ni Seplife ® Profilo del prodotto dei mezzi cromatografici di affinità 6FF (IDA):

Cromatografia di agarosio chelante con Ni  (IDA) lega l'acido iminodiacetico sui mezzi di agarosio 6FF e quindi chela lo ione Ni2+ per essere come un  mezzi cromatografici di affinità . È ampiamente utilizzato per  elaborazione delle proteine ,  acido nucleico  E  purificazione dei polipeptidi  a valle di  biofarmaceutica e bioingegneria .

Ni Seplife ® Parametri della resina per mezzi cromatografici di affinità 6FF (IDA):

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Istruzioni per il test su mezzi cromatografici di affinità:

1.Imballaggio della colonna
(1) Tutto il materiale e il reagente a temperatura ambiente, preparando il tampone iniziale e il flusso di eluizione.
(2)Prelevare un campione di resina in base alle dimensioni della colonna, lavare a secco il 20% di etanolo, utilizzare il tampone (il rapporto resina:tampone = 3:1) per effettuare il trattamento di omogeneizzazione e degasaggio.
(3) Utilizzare acqua o tampone per mantenere umido l'interno o il fondo della colonna, il livello dell'acqua o del tampone deve essere superiore alla membrana del filtro e assicurarsi che il fondo della colonna non presenti bolle.
(4)Utilizzare una bacchetta di vetro per guidare l'omogeneizzato nella colonna insieme alla faccia interna della colonna una volta per evitare la formazione di bolle. Aprire la valvola di uscita della colonna per far sì che la resina si depositi liberamente e collegare bene il tappo superiore della colonna.
(5) Aprire la pompa peristaltica, utilizzare il tampone per passare attraverso la colonna a una portata di 1,33 volte superiore alla portata del tampone normalmente utilizzato. Utilizzare il buffer 2-3BV per bilanciare la colonna.
2.Equilibrio
Bilanciare con 2~5 volumi di letto di soluzione tampone iniziale fino a quando la conduttività, il pH e gli altri parametri non rimangono invariati.
3.Caricamento del campione
(1)Il campione viene generalmente disciolto nel tampone iniziale di pH 6-8 e l'aumento del pH del tampone di caricamento può aumentare il caricamento.
(2)Il tampone non deve contenere EDTA e citrato ed è meglio evitare agenti riducenti come mercaptoetanolo e DTT.
(3)La soluzione tampone comunemente utilizzata contiene da 10 a 100 mmol/L di soluzione tampone di fosfato di sodio, da 20 a 200 mmol/LTris-HCl di soluzione tampone.
(4) Al tampone vengono generalmente aggiunti da 0,15 a 0,5 mol/L di NaCl per eliminare lo scambio ionico.
(5)Quando si utilizza un gel di agarosio chelato di nichel per la prima volta, si consiglia di utilizzare 50 mmol/L di PBS (50 mmol/L NaH2PO4, 0,5 mol/L NaCl, pH 7,4) come tampone iniziale.
4.Eluizione
L'eluizione è generalmente suddivisa nei seguenti metodi:
(1)Ridurre l'eluizione del pH: la maggior parte delle proteine ​​verrà eluita a pH 6-4 (anche a pH 3-4) e il tampone può essere un sistema tampone di acetato di sodio, acido citrico e fosfato.
(2) Eluizione competitiva: aumento lineare o aumento della concentrazione di sostanze concorrenti con affinità per gli ioni metallici (ad esempio 0-0,5 mol/L imidazolo, 0-50 mmol/L istidina, 0-2 mol/L NH4Cl).
(3) Eluizione dell'agente chelante: agenti chelanti come EDTA ed EGTA possono reagire con ioni metallici per provocare l'eluizione della proteina. Tuttavia, questo metodo non può separare proteine ​​diverse e influisce sull'adsorbimento delle proteine, con conseguente incapacità della proteina di fusione di bloccarsi.

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Mezzi cromatografici di affinità Osservazioni:

(1)Quando si utilizza per la prima volta, se la concentrazione di imidazolo richiesta per l'eluizione non è certa, si consiglia di aggiungere 10 mmol/L, 20 mmol/L, 50 mmol/L, 100 mmol/L, 200 mmol/L, 500 mmol/L a il buffer iniziale. L'imidazolo è stato eluito e raccolto rispettivamente dal basso verso l'alto e i risultati eluiti sono stati identificati mediante elettroforesi SDS-PAGE.
(2) L'imidazolo è alcalino e il pH viene regolato con HCl dopo aver preparato il tampone corrispondente.
(3) L'abbassamento dell'eluizione del pH e l'eluizione dell'agente chelante causeranno la caduta degli ioni metallici e gli ioni metallici dovranno essere richelati prima dell'uso successivo.
(4)Condizionalmente, è possibile eseguire un'eluizione lineare in gradiente di imidazolo per determinare le condizioni di eluizione preferite.
Per i metodi di eluizione sopra indicati, è necessario aggiungere al tampone da 150 a 500 mmol/L di NaCl per eliminare lo scambio ionico.
5.Rigenerazione
(1)Il gel deve essere denickato e rigenerato dopo un uso ripetuto o quando è necessario sostituire gli ioni metallici chelati. Metodo di rimozione del nichel: innanzitutto sciacquare la colonna con 5-10 volumi di letto di acqua distillata, quindi sciacquare la colonna con 5-10 volumi di letto di 100 mmol/L EDTA e infine utilizzare 2-3 volumi di letto di 0,5 mol/L NaCl lavaggi eliminare l'EDTA residuo.
(2)La colonna utilizzata più volte generalmente deve essere pulita dopo la rimozione del nichel. Metodo di pulizia: invertire la colonna con 0,1~1,0 mol/L NaOH, mantenerla a 50 cm/h per 1~2 h, non solo può rimuovere le impurità forti, ma rimuove anche la fonte di calore.
(3)Richelazione degli ioni metallici dopo la pulizia. Metodo di chelazione: in primo luogo, la colonna dopo la rimozione del nichel viene completamente equilibrata con 2-5 volumi di letto di acqua distillata, quindi viene utilizzata una soluzione di sale metallico da 0,1 a 0,3 mol/L per far passare da 5 a 10 volumi di letto per chelare gli ioni metallici. Sciacquare con 5-10 volumi di letto di acqua distillata per rimuovere gli ioni metallici non chelati.
6.CIP
(1)Rimozione delle proteine ​​adsorbite mediante scambio ionico: da 2 a 3 volumi del letto sono stati lavati con una soluzione di NaCl da 2 mol/L.
(2) Rimozione di proteine ​​e lipidi fortemente idrofobici, ecc.: 4 volumi del letto sono stati lavati nuovamente con etanolo al 70% o isopropanolo al 30%.
(3) Rimozione della proteina precipitata, proteina idrofoba: fase di rigenerazione del gel di riferimento.
7. Conservazione
Sigillato e conservato a 4~30°C (20% di etanolo nella soluzione di conservazione), asciutto, ventilato, pulito, non congelato; le colonne usate vengono conservate in una soluzione di etanolo al 20% a 4~8°C.

Attenzione:
(1)Il campione e Ni seplife ®6FF (IDA) deve essere equilibrato con il tampone di eluizione e quindi inviato alla colonna cromatografica.
(2)Il letto della colonna deve essere piatto, privo di scanalature e bolle d'aria, altrimenti deve essere reinstallato.
(3) Durante l'utilizzo, assicurarsi che la temperatura della colonna e del tampone siano le stesse, evitando la generazione di bolle nel letto della colonna e influenzando l'effetto di purificazione.
(4) La portata deve essere controllata rigorosamente durante il processo di eluizione e non troppo veloce.
(5)Durante il caricamento e l'intero processo di eluizione, viene impedita l'essiccazione della superficie del cilindro.