Ni Seplife ®Supporto cromatografico di affinità 6FF (IDA)

Resina cromatografica di agarosio chelante al nichel

Ni Seplife 6FF (IDA) Istruzioni

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Profilo del prodotto del supporto cromatografico di affinità:

Cromatografia di agarosio chelante Ni  (IDA) lega l'acido iminodiacetico al terreno di coltura dell'agarosio 6FF e quindi chela lo ione Ni2+ per essere come un  mezzi cromatografici di affinità . È ampiamente utilizzato per la  elaborazione delle proteine ,  acido nucleico  E  purificazione del polipeptide  a valle di  biofarmaceutica e bioingegneria .

Ni Seplife ® Parametri della resina per cromatografia di affinità 6FF (IDA):

Ni Seplife ® Istruzioni per il test del terreno cromatografico di affinità 6FF (IDA):

1.Imballaggio a colonna
(1)Tutto il materiale e il reagente a temperatura ambiente, preparazione del tampone iniziale e dell'eluizione prima.
(2)Prelevare un campione di resina in base alle dimensioni della colonna, lavare con etanolo al 20% per asciugarlo, utilizzare un tampone (rapporto resina:tampone = 3:1) per trasformarlo in omogeneizzato e sottoporlo a trattamento di degasaggio.
(3) Utilizzare acqua o tampone per mantenere l'interno o il fondo della colonna umidi; il livello dell'acqua o del tampone deve essere superiore alla membrana del filtro e assicurarsi che il fondo della colonna non presenti bolle.
(4) Utilizzare una bacchetta di vetro per guidare l'omogeneizzato nella colonna lungo la superficie interna della colonna una volta sola, per evitare la formazione di bolle. Aprire la valvola di uscita della colonna per consentire alla resina di depositarsi liberamente e ricollegare bene il tappo superiore della colonna.
(5) Aprire la pompa peristaltica e utilizzare il tampone per far passare la colonna a una portata 1,33 volte superiore a quella del tampone normalmente utilizzato. Utilizzare un tampone da 2-3 BV per bilanciare la colonna.
2. Equilibrio
Bilanciare con 2~5 volumi di letto di soluzione tampone iniziale fino a quando la conduttività, il pH e gli altri parametri rimangono invariati.
3. Caricamento del campione
(1) Il campione è generalmente disciolto nel tampone iniziale con pH 6-8 e l'aumento del pH del tampone di caricamento può aumentare il caricamento.
(2) Il tampone non deve contenere EDTA e citrato ed è meglio evitare agenti riducenti come mercaptoetanolo e DTT.
(3)La soluzione tampone comunemente utilizzata contiene una soluzione tampone di fosfato di sodio da 10 a 100 mmol/L e una soluzione tampone di Tris-HCl da 20 a 200 mmol/L.
(4)In genere, al tampone vengono aggiunti da 0,15 a 0,5 mol/L di NaCl per eliminare lo scambio ionico.
(5)Quando si utilizza per la prima volta un gel di agarosio chelato di nichel, si consiglia di utilizzare 50 mmol/L PBS (50 mmol/L NaH2PO4, 0,5 mol/L NaCl, pH 7,4) come tampone iniziale.
4.Eluizione
L'eluizione è generalmente suddivisa nei seguenti metodi:
(1) Ridurre l'eluizione del pH: la maggior parte delle proteine ​​verrà eluita a pH 6-4 (anche a pH 3-4) e il tampone può essere costituito da sistemi tampone acetato di sodio, acido citrico e fosfato.
(2)Eluizione competitiva: aumento lineare o incremento della concentrazione di sostanze concorrenti con affinità per gli ioni metallici (ad esempio 0-0,5 mol/L imidazolo, 0-50 mmol/L istidina, 0-2 mol/L NH4Cl).
(3) Eluizione dell'agente chelante: agenti chelanti come EDTA ed EGTA possono reagire con gli ioni metallici causando l'eluizione della proteina. Tuttavia, questo metodo non riesce a separare proteine ​​diverse e ne compromette l'adsorbimento, impedendo alla proteina di fusione di aderire.

Ni Seplife ® 6FF (IDA) Osservazioni sui supporti cromatografici di affinità:

(1) Al primo utilizzo, se la concentrazione di imidazolo necessaria per l'eluizione non è certa, si raccomanda di aggiungere 10 mmol/L, 20 mmol/L, 50 mmol/L, 100 mmol/L, 200 mmol/L e 500 mmol/L al tampone iniziale. L'imidazolo è stato eluito e raccolto, rispettivamente, da una concentrazione bassa ad una concentrazione alta, e i risultati eluiti sono stati identificati mediante elettroforesi SDS-PAGE.
(2) L'imidazolo è alcalino e il pH viene regolato con HCl dopo aver preparato il tampone corrispondente.
(3) L'abbassamento del pH dell'eluizione e l'eluizione dell'agente chelante causeranno la caduta degli ioni metallici, che dovranno essere nuovamente chelati prima del successivo utilizzo.
(4)Condizionalmente, è possibile eseguire un'eluizione lineare del gradiente di imidazolo per determinare le condizioni di eluizione preferite.
Per i metodi di eluizione sopra descritti, è necessario aggiungere al tampone da 150 a 500 mmol/L di NaCl per eliminare lo scambio ionico.
5.Rigenerazione
(1) Il gel deve essere rimosso e rigenerato dopo un uso ripetuto o quando è necessario sostituire gli ioni metallici chelati. Metodo di rimozione del nichel: lavare innanzitutto la colonna con 5-10 volumi di letto di acqua distillata, quindi lavare la colonna con 5-10 volumi di letto di EDTA 100 mmol/L e infine utilizzare 2-3 volumi di letto di NaCl 0,5 mol/L per rimuovere l'EDTA residuo.
(2) La colonna utilizzata più volte deve generalmente essere pulita dopo la rimozione del nichel. Metodo di pulizia: invertire la colonna con 0,1~1,0 mol/L di NaOH, mantenendola a 50 cm³/h per 1~2 ore, in modo da rimuovere non solo le impurità più resistenti, ma anche la fonte di calore.
(3) Rinchelazione degli ioni metallici dopo la pulizia. Metodo di chelazione: in primo luogo, dopo la rimozione del nichel, la colonna viene completamente equilibrata con 2-5 volumi di letto di acqua distillata, quindi si utilizza una soluzione di sale metallico da 0,1 a 0,3 mol/L per far passare 5-10 volumi di letto per chelare gli ioni metallici. Risciacquare con 5-10 volumi di letto di acqua distillata per rimuovere gli ioni metallici non chelati.
6.CIP
(1)Rimozione delle proteine ​​adsorbite mediante scambio ionico: da 2 a 3 volumi del letto sono stati lavati con una soluzione di NaCl 2 mol/L.
(2)Rimozione di proteine ​​e lipidi fortemente idrofobici, ecc.: 4 volumi del letto sono stati lavati con etanolo al 70% o isopropanolo al 30%.
(3)Rimozione della proteina precipitata, proteina idrofobica: fase di rigenerazione del gel di riferimento.
7. Conservazione
Sigillate e conservate a 4~30°C (soluzione di conservazione con etanolo al 20%), asciutte, ventilate, pulite e non congelate; le colonne usate vengono conservate a 4~8°C in una soluzione di etanolo al 20%.

Attenzione:
(1) Il campione e la seplife di Ni ®6FF (IDA) deve essere equilibrato con il tampone di eluizione e poi inviato alla colonna cromatografica.
(2) Il letto della colonna deve essere piano, privo di scanalature e bolle d'aria, altrimenti deve essere reinstallato.
(3) Durante l'uso, assicurarsi che la temperatura della colonna e del tampone siano le stesse, evitando la generazione di bolle nel letto della colonna e compromettendo l'effetto di purificazione.
(4) La portata deve essere rigorosamente controllata durante il processo di eluizione e non deve essere troppo veloce.
(5)Durante il caricamento e l'intero processo di eluizione, si impedisce che la superficie del cilindro si asciughi.